金线莲主要成分kinsenoside的体外抗癌活性研究

作者：蔡金艳1， 张锦文2，3，唐菲3，4，张小琼3，4，徐江涛3，4，张勇慧3，4*               

 作者单位：

(1.广东药学院·药科学院，广东 广州510006;

2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉430030;

3.华中科技大学同济医学院·药学院，湖北 武 430030;

4.湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室，湖北 武汉430030)

【摘要】  目的对金线莲Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.中富含的主要成分kinsenoside进行抗癌活性研究。方法采用磺酰罗单明Sulforhodamine B (SRB)法和MTT分析法。结果对3种敏感细胞株：人白血病细胞株 ( HL-60 )、人肺癌细胞株 (A-549)、人肝癌细胞株(BEL-7402) 筛选结果10-5mmol/L的化合物kinsenoside时抑制率均小于85%，评定为无效。结论化合物kinsenoside的抗癌活性不显著

【关键词】  金线莲;kinsenoside;抗癌

　Abstract：ObjectiveTo investigate the in vitro antitumor effect of kinsenoside, the high yielding constituent from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.　　MethodsSRB assay and MTT colorimetric assay were employed.ResultsThe experimental data of the inhibiting effect of kinsenoside at 10-5mmol/L on three kinds of human leukemia cells ( HL-60 ),human lung cancer cells(A-549)、human hepatic carcinoma cell (BEL-7402) respectively resulted in a ratio no more than 85%,which was assessed no significance.ConclusionKinsenoside has no significant inhibitory effect on cancer cells.

　　Key words：Anoectochilus roxburghii;Kinsenoside;Anticancer

　　金线莲(Herba Anoectochili)为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.的干燥全草，是多年生珍稀中草药，有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛之功效，可用于治疗肺结核咯血、糖尿病、肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿性关节炎、小儿惊风、妇女白带以及毒蛇咬伤等症;生于山地林下阴湿地，在我国分布于浙江、福建、台湾、江西、西藏等省区[1]，俗称“金草”“神药”“药王”“乌人参”等。化学成分方面除发现金线莲中氨基酸，微量元素及糖类的含量高外，还有黄酮类、甾体、三萜类等化合物分离鉴定的报道[2~4]。通过对野生金线莲的化学成分研究，鉴定了两个丁酸苷类化合物β-D- glucopyranosyl- (3R) –hydroxybutanolide (Ⅰ,kinsenoside), methyl 4-β-D- glucopyranosyl- butanoate (Ⅱ)[5]，并发现kinsenoside含量很高。Kinsenoside作为开唇兰属多种植物含有的主要成分，其降血糖[6]、保肝护肝[7]、降血脂[8]等活性已多有研究。本实验选取3种敏感的肿瘤细胞株，对该化合物进行抗肿瘤活性测试。

　　1材料与试剂

　　1.1肿瘤细胞株和培养基人白血病细胞株HL-60、人肺癌细胞株A-549、人肝癌细胞株BEL-7402 (中国科学院细胞库)培养在含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640 培养基(Gibco公司)中，培养条件为：37℃，饱和湿度，5% CO2的培养环境。

　　1.2试剂3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)(Sigma公司)溶解在过滤除菌的1×PBS(pH值7.4，NaCl 0. 8%，KCl 0.02%，Na2HPO4 0.144%，KH2 PO4 0. 024% )，终浓度0. 5 mg/ml;SRB (美国Sigma公司)溶解在1%的乙酸，终浓度4 mg/ml;SDS(北京鼎国生物技术发展有限公司)溶解在10 mmol/L的盐酸中，终浓度为10%;注射用盐酸阿霉素(Adriamycin, ADM)购自浙江海正药业股份有限公司。受试药kinsenoside纯度经鉴定在98%以上;金线莲药材由福建省漳州市南靖县和溪镇供销社提供，由中国科学院武汉植物研究所王映明教授鉴定。

　　2方法

　　2.1MTT比色法体外抗肿瘤药物筛选取处于指数增长期细胞种在96孔板里(细胞浓度为20 000个/ml，100 μl /孔) ，培养24 h使细胞贴壁，去除上清，加200 μl /孔带药新鲜培养基：化合物事先溶解在DMSO或者生理盐水里，当测试时用完全培养基稀释成所需浓度，注意DMSO 终浓度不能超过0.1%。每个浓度设6个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)和阴性对照,同样设6个复孔。培养实验要求时间，去除上清，加100 μl /孔浓度0. 5 mg/ml 的MTT。培养4 h 后再补加100 μl/孔的10%的SDS。37℃下10 h后取出，微震荡5 min，放置室温下30 min，在A570nm波长下测OD值,并计算抑制率。抑制率(%)=对照组OD值-测试组OD值对照组OD值×100%

　　2.2SRB法体外抗肿瘤药物筛选取处于指数增长期细胞种在96孔板里(细胞浓度为20 000个/ml，100 μl/孔)，培养24 h使细胞贴壁，去除上清，加200 μl/孔带药新鲜培养基：化合物事先溶解在DMSO或者生理盐水里，当测试时用完全培养基稀释成所需浓度，注意DMSO终浓度不能超过0.1%。每个浓度设6个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)和阴性对照，同样设6个复孔。继续培养至试验设计时间，终止培养，去除上清，每孔加10% TCA 200 μl，4℃条件固定l h。用二次蒸馏水冲洗5遍，自然晾干后每孔加入4 mg/ml SRB溶液，室温下染色15 min，弃上清，用1%乙酸冲洗5遍以去除非特异性结合的染料。每孔加入100 μl 10 mmol/L Tris溶液，在A515nm波长下测OD值，并计算抑制率(计算方法同MTT比色法)。

　　3结果

        见表1~2。表1阳性对照药品VP-16对肿瘤细胞的抑制作用表2kinsenoside的抗肿瘤活性筛选结果

　　4讨论

　　从上述的测试结果来看，化合物kinsenoside 对敏感细胞株初筛的细胞毒活性不明显，不再进行其他细胞株的复筛。本研究将化学与药理方面有机结合起来，对金线莲中富含[8]的主要成分kinsenoside在抗肿瘤方面的药理活性进行了测试，为全面评价活性化合物kinsenoside的药理作用和药用价值提供了科学依据。王常青等[9]初步研究表明，台湾金线莲多糖对癌细胞具有较好的杀伤作用，民间神药金线莲治疗癌症的物质基础还有待进一步深入研究。

【参考文献】

  　[1]谢宗万.全国中草药汇编，下册[M]. 北京:人民卫生出版社,1992：392.

　　[2]何春年,王春兰,郭顺星，等. 福建金线莲的化学成分研究[J]. 中国药学杂志,2005,40 (8) :581.

　　[3]何春年,王春兰,郭顺星，等. 福建金线莲的化学成分研究Ⅱ[J].中国中药杂志,2005,30 (10) :761.

　　[4]关璟,王春兰,郭顺星. 福建产金线莲中黄酮苷成分的研究[J].中草药, 2005,36(10):1450.

　　[5]蔡金艳，张勇慧，吴继洲，等.金线莲化学成分的研究[J].中药材,2008，31(3)：370.

　　[6]Zhang YH ,Cai J Y, Pi HF ,et al. Antihyperglycemic activity of kinsenoside, a high yielding constituent from Anoectochilus roxburghii in streptozotocin diabetic rats[J].Ethnopharmacology , 2007,114 :141.

　　[7]Wu JB, Lin WL, Hsieh CC et al. The hepatoprotective activity of kinsenoside from Anoectochilus formosanus.[J].Phytother Res，2007 Jan，21(1):58.

　　[8]Du X, Sun N, Tamura T et al. Higher yielding isolation of kinsenoside in Anoectochilus and its antihyperliposis effect[J].Biol Pharm Bull，2001，24(1):65.

　　[9]王常青,严成其,王勇，等.台湾金线莲多糖的分离纯化及其体外抑瘤活性研究[J]. 中国生化药物杂志,2008 ,29 (2) :93.